Sulla scorta della relazione scientifica presentata dal Dr. Alberto Burlina direttore della U.O.C. MME  e del Laboratorio MME   del Campus Biomedico Pietro d’Abano in A.O. di Padova  in ordine ad un progetto di ricerca finalizzato alla messa a punto di nuovi metodi diagnostici sulla Malattia di Niemann-Pick , l’Associazione Cometa A.S.M.M.E. ha acquistato a favore del Laboratorio medesimo lo Spettrometro Waters UPLC  Xevo TQ-MS  necessario per la conduzione di tale ricerca.

  RELAZIONE SCIENTIFICA per l’acquisto di uno strumento TANDEM-MASS spettrometro Waters UPLC Xevo TQ-MS.

Il Laboratorio dell’Unità Operativa Complessa di Malattie Metaboliche Ereditarie dell’Azienda Ospedaliera di Padova è uno dei pochi centri sul territorio italiano specializzati nella diagnosi di malattie metaboliche ereditarie, da decenni infatti è impegnato nello sviluppo di nuovi metodi diagnostici che permettano di individuare rapidamente e con specificità rare patologie ereditarie del metabolismo.

In questo contesto nasce un nuovo progetto di ricerca che ha come finalità la messa a punto di un metodo che permetta la diagnosi di una rara patologia, la malattia di Niemann-Pick di tipo C (NP-C) un disordine neurodegenerativo caratterizzato dall’accumulo nella cellula a livello endolisosomiale di colesterolo e altri glicolipidi. La malattia a trasmissione autosomica recessiva causata nel 95% da mutazioni del gene NPC1 e nel restante 5% da mutazioni che coinvolgono il gene NPC2. L’incidenza stimata della patologia in Europa occidentale è di circa 1 su 120.000-150.000, si ritiene però che questo numero sia largamente sottostimato a causa delle difficoltà diagnostiche. Le manifestazioni cliniche sono eterogenee e legate all’età di esordio. In età infantile gli individui affetti presentano atassia e una progressiva perdita delle funzioni motorie e intellettive, l’esordio precoce è generalmente associato ad una più rapida progressione dei sintomi che causano la morte già in età adolescenziale.

Nella malattia di Niemann Pick tipo C, come per altre patologie neurodegenerative, il tempo di diagnosi è un fattore critico, un intervento precoce può infatti produrre migliori benefici nel paziente affetto. Ad oggi però la principale barriera ad una terapia efficace per questa patologia è la mancanza di un test diagnostico, non invasivo ed economico, che eviti il ritardo diagnostico, in genere di circa sei anni.

L’introduzione in commercio di un farmaco in grado di rallentare la progressione della malattia di Niemann Pick tipo C assieme alle difficoltà di diagnosi di questa rara patologia neurologica rendono sempre più necessario lo sviluppo di nuovi metodi diagnostici rapidi e poco invasivi che ne facilitino l’individuazione.

Nel 2010, il gruppo di ricerca coordinato da D.S. Ory, attraverso studi su topi chimera knock out per il gene Npc1, ha individuato due marcatori ad elevata sensibilità e specificità per la patologia, il colestano-3β,5α,6β-triolo (3β,5α,6β-triolo) e il 7-chetocolesterolo (7-KC) due composti che si formano dal colesterolo per ossidazione spontanea.

In uno studio ancora più recente, lo stesso gruppo ha valutato attraverso un metodo in HPLC-MS/MS le concentrazioni plasmatiche dei due ossisteroli nel plasma di 109 pazienti affetti da NP-C, confrontando i valori ottenuti con quelli di 89 controlli e 45 parenti di pazienti con NP-C sani ed eterozigoti per la mutazione genica. In accordo con lo studio precedente, le concentrazioni plasmatiche di questi due marcatori sono risultate significativamente al di sopra della norma nei soggetti NP-C, e dimostrano elevata sensibilità e specificità (97% e 100%).

Lo scopo del nostro studio è utilizzare le informazioni riportate in letteratura per sviluppare e validare un metodo in HPLC accoppiato ad uno spettrometro a triplo quadrupolo che permetta l’identificazione e il dosaggio dei due ossisteroli.

Le prove condotte finora, utilizzando le attrezzature attualmente presenti in laboratorio (spettrometro Waters Acquity TQD donato dall’Associazione Cometa ASMME) paragonate ai risultati riportati nell’articolo di Ory et al. hanno dimostrato una scarsa sensibilità della macchina per le due molecole analizzate. Il limite di sensibilità infatti è di 25 ng/ml, un valore che coincide con i valori medi dei due analiti nella popolazione normale.

Dal confronto con i dati riportati in letteratura si evince inoltre che lo spettrometro di massa utilizzato nell’articolo rispetto a quello posseduto dal nostro laboratorio rientra in una fascia superiore come prestazioni in termini di sensibilità e selettività.

Per risolvere il problema è stata richiesta la consulenza alla ditta Waters, una delle ditte leader nella produzione di spettrometri di massa, che ha messo a disposizione gli specialisti dei laboratori Waters di Manchester. Le prove sono state condotte su campioni preparati dal nostro laboratorio su uno spettrometro di nuova generazione, lo Xevo TQ MS. I risultati del loro studio dimostrano che lo strumento è molto più sensibile e permette di quantificare facilmente piccole quantità di ossisteroli con un limite di quantificazione 3.125 ng/mL.

Le caratteristiche dello Xevo TQ-MS, elevata sensibilità e specificità, lo rendono ideale sia per lo sviluppo del metodo per il dosaggio plasmatico degli ossisteroli sia per lo messa a punto di nuove metodiche diagnostiche che finora non è stato possibile ricercare per  la mancanza di uno strumento adeguato.

Inoltre tale strumento potrà fungere da back-up  allo spettrometro di massa Acquity TQD già presente in laboratorio donato da Cometa A.S.M.M.E., permettendo così di potenziare e rafforzare le capacità del laboratorio nello screening neonatale esteso.

                                     Dr. Alberto Burlina

                                              Direttore U.O.C.  Malattie Metaboliche ed Ereditarie

                                                   Azienda Ospedaliera-Università di Padova